ATCC細(xì)胞在不加任何條件下直接凍存時，細(xì)胞內(nèi)和外環(huán)境中的水都會形成冰晶，能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)發(fā)生機械損傷、電解質(zhì)升高、滲透壓改變、脫水、PH改變、蛋白變性等，能引起細(xì)胞死亡。如向培養(yǎng)液加入保護(hù)劑，可使冰點降低。在緩慢的凍結(jié)條件下，能使細(xì)胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細(xì)胞。貯存在-130℃以下的低溫中能減少冰晶的形成。
ATCC細(xì)胞可能由于各種原因相互附著并發(fā)生結(jié)團(tuán)。細(xì)胞結(jié)團(tuán)的常見的原因是在細(xì)胞裂解之后，培養(yǎng)基中存在游離DNA和細(xì)胞碎片，DNA的粘性使細(xì)胞和其他碎片聚集成大的團(tuán)塊。以下是細(xì)胞裂解和DNA被釋放到培養(yǎng)基中的一些原因：
1.消化過度：過度使用蛋白水解酶可能會導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)團(tuán)。
2.環(huán)境應(yīng)力：機械力、反復(fù)凍融循環(huán)和其他環(huán)境應(yīng)力可加速細(xì)胞死亡，早期現(xiàn)象可能是細(xì)胞和細(xì)胞粘附。
3.組織分解：通過化學(xué)、機械或酶法從初生組織制備單細(xì)胞懸浮液可能會導(dǎo)致一些細(xì)胞破裂。從組織制備單細(xì)胞懸浮液時，通常需要膠原酶消化細(xì)胞外基質(zhì)。
4.過度生長：當(dāng)細(xì)胞達(dá)到融合狀態(tài)時，細(xì)胞碎片和細(xì)胞裂解產(chǎn)生的游離DNA就會堆積過多。
那么我們該如何預(yù)防細(xì)胞結(jié)團(tuán)呢？細(xì)胞結(jié)團(tuán)會減少細(xì)胞對關(guān)鍵營養(yǎng)素的獲取，從而阻礙整體細(xì)胞的生長。細(xì)胞結(jié)團(tuán)還會影響需要清潔制備單個細(xì)胞的下游檢測，根據(jù)結(jié)團(tuán)的根本原因，下找出合理的解決方案：
1.細(xì)胞裂解與DNA釋放：DNaseⅠ可用于組織降解以及常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)過程中，以防止多種類型細(xì)胞的結(jié)團(tuán)。
注意：DNaseⅠ在二價離子（如Mg2+，Ca2+）存在時活性大。
2.二價陽離子：檸檬酸鹽和EDTA等螯合劑可以用于去除細(xì)胞培養(yǎng)基中的鈣離子。也可使用無血清、無Ca2+/Mg2+平衡鹽溶液。
3.細(xì)胞密度：細(xì)胞在傳代前，參考細(xì)胞系文獻(xiàn)或者已知的特性來獲取推薦的細(xì)胞密度。
4.操作：在進(jìn)行細(xì)胞分離時，應(yīng)小心處理細(xì)胞并使用適當(dāng)?shù)碾x心機設(shè)置。微小的結(jié)團(tuán)可以通過攪碎，或者輕柔地上下吹打細(xì)胞來解決。
5.支原體污染：處理掉被污染的細(xì)胞，消毒培養(yǎng)室和細(xì)胞培養(yǎng)箱。遵循良好的實驗室規(guī)范以避免污染。
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