蛋白不表達或表達量很低?
1、選擇正確的表達載體與表達菌株
• T7啟動子的載體(如pET系列載體)應選用BL21(DE3),BL21(DE3) pLysS,Transetta(DE3) 等菌株。非T7啟動子的表達載體 (如Tac啟動子的pGEX、pMAL系列表達載體) 應選用BL21表達菌株。
• 對細胞有毒性的蛋白,建議選用背景表達低、嚴謹調(diào)控誘導的菌株,如BL21(DE3) pLysS菌株。
• 對于帶有稀有密碼子的蛋白或來源于真核基因的蛋白,建議選用Transetta(DE3) 等菌株。
2、嘗試不同的表達載體與菌株
不同的蛋白,對不同載體與菌株的偏好不同,如果某一蛋白無法通過優(yōu)化誘導表達條件得到明顯改善,可以更換其它菌株或表達載體。
3、表達條件的優(yōu)化
• 選擇不同的培養(yǎng)基。對于某些蛋白,在培養(yǎng)基中加入適量的葡萄糖(0.1%-0.5%),可以明顯提高表達量。
• 較高的溫度、較高的誘導物濃度、較長的表達時間,一般可以加快表達的速度,促進目的蛋白的積累,從而提高表達量。但可能會降低可溶蛋白的表達量,形成包涵體。
• 細胞的生長狀態(tài)對蛋白表達有很大的影響,可以通過測量菌液的OD600值監(jiān)測生長狀態(tài)。對于大部分蛋白,應在菌株的對數(shù)生長期(OD600=0.5) 進行誘導。
目的蛋白不可溶,形成包涵體?
首先確認目的蛋白是否有表達。
• 裂解菌體并離心后,通過對全菌、上清、沉淀的檢測,確認目的蛋白是否表達,是否形成了包涵體。
• 包涵體的形成與蛋白自身結(jié)構(gòu)、表達系統(tǒng)、誘導表達條件等因素有著密切關系。在無法改變蛋白自身結(jié)構(gòu)的情況下,可以嘗試不同的表達載體與菌株,增強其溶解能力,優(yōu)化出適合特定蛋白的表達系統(tǒng)。
• 目前認為包涵體的形成是由于蛋白在細胞內(nèi)積累速度過快,沒有正確折疊而聚集沉淀??梢酝ㄟ^優(yōu)化誘導表達條件,如降低誘導溫度、降低誘導物濃度、縮短表達時間、降低誘導時菌液的OD值等,以減緩蛋白的積累。
目的蛋白大小不正確?
• 蛋白的結(jié)構(gòu)對判斷分子量大小有一定影響??梢酝ㄟ^加熱變性蛋白,從而準確判斷蛋白分子量大小。
• 確認蛋白表達是否完整,蛋白是否提前終止表達。
• 若形成二聚體甚至多聚體,可以通過加熱變性蛋白、打開二硫鍵 (加入DTT、β-ME等還原劑) 等手段,破壞次級結(jié)構(gòu),準確判斷分子量大小。
原核蛋白表達推薦產(chǎn)品
IPTG
表達感受態(tài)細胞